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电镜标本取材方法与要求1
[日期:2010-01-31]  来源:  作者: 
 

一、材准备

首先,实验者要预先准备好平皿、碎冰或冰袋、蜡板、固定液、锋利的刀片、干净的小玻璃瓶若干个等取材物品。取材之前先在蜡板(用切片石蜡置培养皿中溶解后再冷却即可)上12预先在4℃冰箱内冷却的固定液(一般为2.5%或3%磷酸缓冲液缓冲的戊二醛),将取出的组织放在固定液当中,用新的、锋利的刀片采用双刀拉锯法,将组织块尽量修小,一般不超过1mm3,或者可将组织修成大小1mm×1mm×2mm长条形,然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中(组织块体积与固定液体积之比大约为1:40),然后在瓶子上做好标签或标记,避免组织混淆不清。如果组织带有较多的血液或其它组织液,应先用生理盐水或直接用固定液洗几遍,然后再照以上方法切成小块进行固定。

以下为双刀拉锯法取材示意图:

另外需要注意的是,一些组织比如多数上皮组织(皮肤、腺上皮、内皮、粘膜上皮等)以及神经组织、肌肉组织等具有一定的层次和方向,必须进行定向取材,其方法如下图所示:

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二、几种器官组织取材方法简介

1、睾丸与附睾取材方法:要观察生精细胞(主要是研究精子发生过程中的各种变化)、支持细胞以及睾丸间质细胞,应取材于睾丸的睾丸网部位。大鼠与小鼠的睾丸网比较表浅,就在白膜下附近,此处曲细精管比较丰富,而且间质细胞较多。如果要观察成熟精子(主要是精子形态的变化),应取材于附睾的尾部,此处精子已基本成熟,而且精子密度最高。

2、脑组织取材方法:如要研究神经元、突触及血脑屏障等结构结构,建议取材于脑皮质的灰质部分,靠近脑组织边缘位置,此处突触、树突、神经元以及毛细血管比较丰富。如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞,应取材于脑组织白质部分,此处有髓神经纤维相对较多,胶质细胞比较丰富。脊髓神经元主要在脊髓灰质部位,要注意确定神经元排列方向,最好在纵横方向各取若干长条形组织块进行定向取材和包埋。

3、肺组织取材方法:要观察支气管粘膜或肺打、中动脉,应取材于靠近肺门部位。要观察肺细小支气管和肺细、小动脉,应取材于肺叶的中野位置稍偏肺尖方向。如果要观察肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构等,建议取材于肺尖部或靠近胸膜一侧的肺边缘部位。

由于肺组织内部存在较多气体,固定也难以迅速进入组织内部进行固定,我们一般采用载玻片挤压法,具体操作:首先准备好两片干净的载波片,在其中一片上滴一滴固定液,同时将组织放在固定液上,用另外一片载玻片轻轻压在上面并轻轻挤压,直到气泡消失为止

4、肾组织取材方法:要观察肾小球和近曲小管,应取材于肾皮质组织靠近肾的上极,这里一般都会有肾小球存在,近曲小管比较丰富,是研究肾小球和肾小管疾病的理想位置

5、肠道取材法:胃肠道主要观察部位一般是粘膜上皮组织和固有层组织,需要定向取材,一般沿着胃肠道纵轴和横轴各若干条长约2毫米,宽约1毫米的长条形组织块,尽量包括粘膜全层结构,注意保护粘膜层细胞免受人为损伤,同时注意要清洁粘膜游离细胞取材法表层本方法同样适用于心肌内膜、膀胱内膜、输尿管、血管等组织器官。

6、骨组织取材方法:取小块骨片(1~2mm大小),先用2.5%戊二醛固定2小时,磷酸缓冲液漂洗2次,再将骨片浸入脱钙液进行脱钙处理,视脱钙效果而定脱钙时间,如用EDTA脱钙液,大约3天时间,主要视组织块是否变得柔软。软骨组织一般直接固定,不需要脱钙处理。

7、皮肤组织取材方法: 皮肤组织一般观察表皮细胞及部分固有层结构,取材以长条形为主,长约1.5mm,横径在0.5mm-1.0mm,包括表皮全层细胞及部分固有层(依据上文定向取材图示处理),表皮是复层鳞状上皮层,无血管分布。真皮部分位于表皮深面,主要由胶原纤维和弹性纤维交织构成,并含有从表皮陷入的毛发和腺体,以及从深层来的血管、淋巴管、神经及其末梢一般不需要定向取材,但要注意位置的准确。

8、外周神经纤维的取材方法:脊椎动物的外周神经系统包括由脑发出的脑神经和由脊髓按节段性排列发出的脊神经。按所联系的器官不同,可分为躯体和内脏两大类,每一类又可按照传导兴奋的方向不同而分为传入神经和传出神经两类。取神经纤维时,应分离掉包裹神经的神经外衣,再分离出所要研究的神经。如果神经纤维直径在1mm以内,可直接切成1.5mm长条形即可,如果直径较大,则一分为二,同样切成长条形。需要注意的是,在包埋的时候必须定向包埋,纵横方向都要包埋。

9、骨骼肌的取材方法:每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官,有丰富的血管、淋巴分布,在躯体神经支配下收缩或舒张,进行随意运动。肌肉具有一定的弹性,当外界刺激较激烈的情况下,肌肉往往出现痉挛现象,因此,切取肌肉组织后应先浸泡在室温下的生理盐水或磷酸缓冲液中,等肌肉恢复自然常态后再浸入固定液内进行固定,取材大小与方向基本同神经纤维取材方法相似。需要注意的是,在包埋的时候必须定向包埋,纵横方向都要包埋。

10、胰腺的取材方法:胰腺可分为胰头、胰体和胰尾三部分。胰腺一般观察胰岛细胞、腺泡细胞以及导管细胞,胰岛主要分布在胰尾部位,胰体部位较少,腺泡及导管基本存在于胰体内,容易观察。组织可以直接浸入固定液内固定。

11、肿瘤组织取材方法:肿瘤的生长位置几乎遍布全身,肿瘤组织主要观察肿瘤细胞的组织来源、细胞类型、分化程度以及与周围组织的关系等内容。电镜标本的取材应多位置取材,包括肿瘤的实体内部、生长发生部位以及与周围正常组织的连接部位,各部位均要取若干个组织块进行固定,这样才能观察的比较全面,尤其怀疑是恶性肿瘤的组织。大小约1mm*1mm*1mm,不能过大。

12游离细胞或分散细胞取材方法:1凝集法(包括骨髓血)血液抗凝处理后进行离心分层(2000/每分钟,10—20分钟),用毛细吸管沿着管壁轻轻的将上清吸取(不要破坏最上层细胞层),接着用吸管吸取固定液,并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入,动作轻柔,不能将细胞团冲散,然后把它放在4冰箱内固定保存。2)血清混合法:主要针对细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞等游离细胞,先将它们用磷酸缓冲液或生理盐水制成悬液,移到离心管内(最好是玻璃的)进行离心成团(10003000/分钟,10分钟,下同),用毛细吸管吸去上清液后加入2.5%戊二醛,并用细针轻轻混匀,固定10分钟左右,离心,同样弃去多余的固定液,然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀,离心成团,去上清液,用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿着离心管壁缓慢滴入,尽量避免团块分散,静置于4冰箱内固定保存。

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