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超薄切片技术3
[日期:2008-11-23]  来源:  作者: 
 

局部灌注固定的器官为肝、胃肠道、肾、骨髓和睾丸等,灌注位置开在腹主动脉,以肾静脉或髂静脉作为回流出口;脑组织的灌注位置在颈动脉,以颈静脉或右心房作为回流出口。 附表 局部灌注时灌注压力和流量


脏器

灌注压力( kPa )

灌注流量( ml/min )

肝、胃肠道

骨髓
睾丸

16.0 ~ 18.7
16.0 ~ 18.7
24.0 ~ 26.7
26.7 ~ 29.3
18.0 ~ 20.5

9 ~ 10
9 ~ 10
11 ~ 12
12 ~ 13
10 ~ 11

三.脱水
为了保证包埋介质完全渗入组织内部,必须事先将组织内的水分驱除干净,即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。急骤的脱水会引起细胞的收缩,因此,脱水应梯度进行: 70% 丙酮 15 分钟, 80% 丙酮 15 分钟, 90% 丙酮 15 分钟, 100% 丙酮1 0 分钟 ( 二次 ) 。游离细胞可适当缩短脱水时间。过度脱水不仅引起更多物质的抽提,而且会使样品发脆,造成切片困难。
四.浸透和包埋
浸透就是利用脱水剂稀释包埋剂,并最终让包埋剂完全渗入到组织内部取代脱水剂的过程。
包埋就是将浸透好的组织放入特定的包埋模内,加入包埋剂再加温聚合成硬块的过程。
理想的包埋剂应具有以下性质:
(1) .粘度低,容易渗入组织,并与脱水剂相混溶;
(2) .聚合均匀而充分,聚合前后体积变化小;
(3) .有良好的切割性能;
(4) .能耐受电子束轰击,高温下不变形,不升华;
(5) .对细胞成分抽提少,微细结构保存良好;
(6) .在电镜的高倍放大下,本身不显示任何结构;
(7) .材料来源丰富、易得,价格低廉,对人体无害。
目前常用的包埋剂是环氧树脂 (epoxy resin) 。环氧树脂是一类高分子聚合物,它的分子中含有两种反应基团,即环氧基和羟基。当加入酸酐类时,树脂分子中的羟基能与酸酐结合,形成分子间的横桥连接,这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂,它们参与交联反应,并被吸收到树脂链中。常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐 ( 或叫十二碳烯基丁二酸酐,简称 DDSA) 、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐 ( 或叫六甲酸酐,简称 MNA) 及顺丁烯二酸酐等。当加入胺类时,就引起末端环氧基相连,形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有 2,4,6 -三 ( 二甲氨基甲基苯酚 , 简称 DMP-30) 、二乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性能,某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂,使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯 ( 简称 DBP) 。
目前国内外普遍采用的包埋剂为 Epon-812 环氧树脂,它是一种进口的环氧树脂,其粘度较低, 25℃ 时为 150 ~ 210 厘泊,聚合前后体积变化小 ( 收缩率为 2% ~ 5%) ,切片在电子束照射下比较稳定,能较好地保存细胞的微细结构。但操作条件要求较严格,如组织块脱水要彻底,包埋时要注意防潮及防止气泡产生,聚合时温度要控制好等。
浸透包埋过程如下:
预先按一定比例将 Epon-812 环氧树脂、 MNA 、 DDSA 以及加速剂混合均匀的包埋剂准备好。将充分脱水干净的组织浸入脱水剂与包埋剂混合液(脱水剂:包埋剂 =1 : 1 )浸透 2 小时,再浸入脱水剂与包埋剂混合液(脱水剂:包埋剂 =1 : 4 )浸透过夜,第二天将组织浸入纯包埋剂 2 ~ 3 小时。
常规包埋在一次性包埋胶囊或特制的定向橡胶模板中进行。首先将胶囊或包埋模置烤箱烘干。用镊子或牙签将组织块放置胶囊底部或橡胶模板中,将包埋液加入包埋模或胶囊中,放上标签,在 45 ℃ (3 ~ 6 小时 ) 、 60 ℃ (36 ~ 48 小时 ) 烤箱内加温,即可聚合硬化,形成包埋块。
包埋操作中应注意以下几点: (1) 所有试剂要防潮,最好存放在干燥器中; (2) 所用器皿应烘干; (3) 配包埋剂时,每加入一种试剂要搅拌均匀; (4) 包埋时动作要轻巧,防止产生气泡; (5) 皮肤尽量不要接触包埋剂,以免引起皮炎; (6) 盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净。
五.超薄切片
( 一 ) 超薄切片前的准备工作
1 .修块
一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在特制的夹持器上,放在解剖显微镜下,先用锋利的刀片削去或用砂纸磨去表面的包埋剂,露出组织,然后在组织的四周以和水平面约成 45 度的角度削去包埋剂,修成锥体形。
2 .半薄切片光镜定位
一般使用玻璃刀在超薄切片机上切出厚度为 0.5μm ~ 1μm 的切片,称厚片或半薄切片。将切下的片子用镊子或小毛刷转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上,加温,使切片展平,吸干或自然干燥后经甲苯胺蓝染色,在光学显微镜下观察定位。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的: (1) 定位:对于超薄切片来说,包埋块中的组织面积还嫌大,还需要修小,如果盲目地修小,就有可能把要观察的部分修掉,因此要切厚片用光学显微镜观察,以便准确定位,保留要用电镜观察的部分,修去其余部分。 (2) 便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后,要对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形,顶面修成梯形或长方形 ( 最好是梯形 ) ,每边的长度不超过 0.2mm ~ 0.3mm 为宜。
3 .制刀
超薄切片使用的刀有两种:一种是玻璃刀,一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜,使用者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃,厚度为 5mm ~ 6.5mm 。
玻璃刀制作可用专门制刀机制备。制刀时,先将玻璃条清洗干净,按照制刀机的操作程序进行制刀,制好玻璃刀后,要围绕刀口制作一只水槽,以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有树胶水槽和胶布水槽两种。树胶水槽有固定的形状,可反复使用。胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水槽后,用熔化的石蜡封固接口,防止漏水。
金刚刀极其锋利,能够迅速切出高质量的超薄切片,节省了大量的时间。但其价格昂贵,使用时一定要极其小心,一旦操作失误,损伤了刀口,将带来巨大损失。这要求操作者必须有深厚的切片功底和技巧,才能延长金刚刀的使用寿命。
4 .载网和支持膜
电镜中使用的载网根据所用材料不同可有铜网、不锈钢网、镍网、钛金网等,一般常用铜网。载网为圆形,直径 3mm 。网孔的形状有圆形、方形、椭圆形等。根据网孔的数目可分为单目、双目、 50 目、 100 目、 200 目、 300 目等多种规格,可根据需要进行选择。
支持膜的制备:
挑选并清洗好载网之后,要在载网上覆盖一层薄膜,这层薄膜称支持膜,厚度为 10nm ~ 20nm 。对支持膜的要求是透明无结构,并能承受电子束的轰击。常用的支持膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜 (Formvar 膜 ) 两种,本室采用后者。
( 二 ) 超薄切片
超薄切片需用超薄切片机进行。根据推进原理不同,将超薄切片机分为两大类:一类是机械推进式切片机,用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进;另一类是热胀冷缩式切片机,利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小长度变化来提供推进。
超薄切片的步骤包括: (1) 安装包埋块; (2) 安装玻璃刀; (3) 调节刀与组织块的距离; (4) 调节水槽液面高度与灯光位置; (5) 调节加热电流及切片速度,切片; (6) 将切片捞在有支持膜的载网上。

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