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超薄切片技术2
[日期:2008-11-23]  来源:  作者: 
 

2 .戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)
戊二醛于 1963 年开始采用,是当前广泛使用的固定剂。戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用,对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强,还能保存某些酶的活力,长时间的固定 ( 几周甚至 1 ~ 2 个月 ) 不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪,没有电子染色作用,对细胞膜的显示较差。
商品戊二醛通常为 25% 的水溶液。大多数市售戊二醛水溶液含有杂质,主要是戊二酸、丙烯酸等,它们可以影响固定质量,尤其对酶的保存。因此要获得好的固定,可对市售戊二醛用活性碳或用蒸馏方法进行提纯。一般戊二醛的 pH 为 4.0 ~ 5.0 ,贮存时间过长时,溶液颜色变黄,酸度增加,当 pH 降至 3.5 以下就不能使用。戊二醛原液应在冰箱保存。
3 .甲醛
甲醛分子量较小,在组织中渗透快,固定迅速,对细胞精细结构的保存虽不如戊二醛,但在酶活性的保存上却优于戊二醛,故多用于细胞化学或快速固定。
一般市售的甲醛溶液中含有抗聚合的甲醇,影响固定效果,因此,固定电镜样品所用的甲醛应在临用前用多聚甲醛粉末制备。配制 10% 多聚甲醛溶液方法如下: 10 克 多聚甲醛粉末加入 100 毫升双蒸水,加热至 60℃ ~ 70℃ ,边搅拌边加入几滴 1N NaOH ,至溶液透明,冷却后备用。
(二)常用固定方法
1 .浸泡固定(也称组织块固定):就是将组织块直接浸泡入固定液当中进行固定,常规采用戊二醛 — 锇酸双重固定法。
1.1. 预固定 ( 或前固定 )
用 2% ~ 4% 戊二醛固定液,或者 2% 多聚甲醛+ 2.5% 戊二醛混合固定液固定 2 ~ 4 小时, pH 值为 7.3 ~ 7.4 ,温度为 4℃ 。固定液的用量为标本的 40 倍左右。
1.2 缓冲液漂洗
漂洗时间 0.5 ~ 2 小时 ( 4℃ ) ,若戊二醛固定时间延长,漂洗时间亦需相应延长,以彻底洗去戊二醛残液。在漂洗期间,注意要换液数次。所用的组织漂洗液一般为同系列缓冲液。
1.3 后固定
用 1% 锇酸固定液固定 1 ~ 2 小时 ( 4℃ ) , pH7.3 ~ 7.4 。固定完毕,用缓冲液漂洗 20 分钟后进行脱水。
2 .游离细胞的固定
适用于培养细胞、周围血、骨髓、胸腹水或其他渗出液。如为贴壁生长的培养细胞,应先用橡皮刮子将细胞从培养管壁上轻轻刮下,或用酶消化,使细胞脱离管壁。
取培养细胞、抗凝静脉血、骨髓或其他标本 2 ~ 4ml ,放细口径试管中离心, 1500 ~ 2000 转 / 分, 10 ~ 15 分钟;接着用滴管吸去上清,沿管壁缓慢加入 2% ~ 3% 戊二醛固定液,静置 30 分钟, 4℃ 冰箱保存。
如为周围血或骨髓,用细针小心将红细胞上面的薄层淡黄色膜 ( 含白细胞及血小板等成分 ) 取出,并切成小块。
如为培养细胞及胸腹水,则将沉在试管底部的细胞团块取出,加入血清或抗凝血浆进行混合预包埋,同时加戊二醛固定 60 分钟以上。然后进行缓冲液漂洗 3 次,每次大约 15 分钟,最后用 1% 锇酸固定液固定 15 ~ 30 分钟。
3 .原位固定法
就是在组织未取下之前,在组织器官原来的位置进行预固定的方法。原位固定可分为点滴固定法和注射固定法两种。
点滴固定法:就是将实验动物麻醉后暴露出所需的器官表面,小心地剥开包膜,将预冷的固定液直接滴在组织的表面上,并保持固定液适当浓度不使挥发干燥。
注射固定法:就是将实验动物麻醉后,将固定液用细注射针直接注射到所需固定的组织中或空腔脏器的内部。
经过以上方法处理后,取下所需组织,依照浸泡固定方法进一步固定。该方法适用于一些比较软或易碎的组织如眼睛、脑和睾丸。
3 .灌注固定法
这是最好的固定方法。它是利用血液循环的途径将固定液灌注到所需固定的组织中,其特点是灌注快速、均匀,缺点是固定操作复杂、要求高。
灌注固定法可分为全身固定和局部固定两种。通常采用的固定剂为 2% ~ 4% 戊二醛溶液或者 4% 多聚甲醛溶液。
以下介绍具体灌注固定方法,以供大家参考。
在进行灌注固定之前首先用 3.5% 水合氯醛(按 35mg/ 100g 体重)或者戊巴比妥钠( 50mg/ 100g 体重)进行腹腔麻醉动物。对于进行全身固定的动物,打开胸腔,暴露心脏;对于局部固定的动物,暴露所需固定的器官的动脉。接着将灌注头插入左心室或相应器官的动脉血管,先用生理盐水灌注,灌注的同时用眼科剪刀剪开右心房或相应的回流静脉,使得循环通畅。当流出的液体清亮不含血液时(大约需要 2 分钟左右),换固定液进行灌注固定,一般灌注固定时间在 10 分钟— 15 分钟,而后采用浸泡固定法进行后续处理。

灌注固定期间需要注意的是,灌注压力不要太高(具体见附表);灌注液温度接近 25 ℃~ 30 ℃ ;血管穿刺要一次性完成,避免引起血管收缩;注意防止血液凝固,可在穿刺之前在腹腔注射 0.4ml 肝素。
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