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超薄切片技术1
[日期:2008-11-23]  来源:  作者: 
 

一.取材
( 一 ) 取材的基本要求
组织从生物活体取下以后,如果不立即进行适当处理,就会出现人为假象,导致取材失败。此外,还可能由于污染,微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此,为了使细胞结构尽可能保持生前状态,取材操作应注意快、小、冷、准四个要点:
(1)、快:就是取材动作要迅速,组织从活体取下后应在最短时间内 ( 争取在 1 分钟内 ) 投入固定液。对于实验动物,最好在断血流、断气之前就进行取材,以免缺血缺氧后使细胞代谢发生改变而破坏细胞的超微结构。当然,最好是采用灌注固定法。
(2)、小:所取组织的体积要小,一般不超过 1mm × 1mm × 1mm 。因为固定剂的渗透能力较弱,组织块如果太大,块的内部将不能得到良好的固定。为便于定向,可将组织修成 1mm × 1mm × 2mm 大小。
(3)、冷:操作最好在低温 ( 0 ℃ ~ 4 ℃ ) 下进行,以降低酶的活性,防止细胞自溶。
(4)、准:就是取材部位要准确,这就要求取材者对所取的组织解剖部位要熟悉,尽量取到与实验要求相关的部位,不同实验组别间要取相同部位,不要盲目取材。
此外,还要求机械损伤要小,解剖器械应锋利,操作宜轻,避免牵拉、挫伤与挤压。
( 二 ) 取材方法
取材之前先在蜡板上滴一滴冷却的固定液,将取出的组织放在固定液当中,用新的、锋利的刀片采用双刀拉锯法,将组织块尽量修小,一般不超过 1mm 3 ,或则可将组织修成 1mm × 1mm × 2mm 大小长条形,然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中,然后在瓶子上做好标签或标记,避免组织混淆不清。如果组织带有较多的血液和组织液,应先用生理盐水或直接用固定液漂洗几遍,然后再照以上方法切成小块固定。

二.固定
固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态,并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。固定的方法有物理的和化学的两大类。物理的方法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结构;化学的方法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。
下面主要介绍固定液特性以及使用化学方法对组织或细胞进行固定的方法。
( 一 ) 常用固定剂的性质
1 .四氧化锇 (osmium tetroxide , OsO4)
四氧化锇又名锇酸,是一种淡黄色、具有强烈刺激味的晶体。它是强氧化剂,与氮原子有较强的亲和力,因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外,四氧化锇还能固定脂蛋白,使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性 DNA 以及核蛋白反应,但不能固定天然 DNA 、 RNA 及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用,用它固定的样品图象反差较好。

四氧化锇的缺点是渗透能力较弱,每小时仅渗透 0.1mm ~ 0.3mm 。用四氧化锇固定的时间一般为 2 小时左右,长时间停留在四氧化锇溶液中会引起一些脂蛋白复合体的溶解,而使组织变脆,造成切片困难。四氧化锇容易蒸发,其蒸气对皮肤、呼吸道粘膜及眼睛角膜有伤害作用。因此,使用时要注意通风,操作宜在通风橱中进行。因受热或可见光会促使四氧化锇氧化,故应保存于避光和阴凉处。
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