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超薄切片技术
[日期:2008-11-23]  来源:  作者: 
 
由于普通电镜产生的电子束穿透能力很弱,只有在高真空条件下才能达到一定的自由行程,所以电子显微镜所观察的样品必须很薄,一般的加速电压在 100kV 左右的透射电镜其标本厚度不要超过 100nm, 超高压电镜的标本切片厚度可以达到 1 μ m 。因此,大家习惯把切片厚度在 1 μ m 以下的薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是 50-100nm 。在透射电镜的样品制备方法中,超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。 超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似,需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步骤。但是,由于电镜的高分辨本领以及电子束的照射很易使样品变形,因此对超薄切片技术提出了更高的要求。为了获得理想的超薄切片,操作者必须十分认真地对待每一个步骤,任何环节的疏忽都有可能使制片失败。
透射电镜样品制作操作流程: 取材 —— 漂洗(生理盐水) —— 前固定( 2.5% 戊二醛, 4oC 冰箱 2 小时以上) —— 漂洗( 0.1M 磷酸缓冲液, 3 次, 45 分钟) —— 后固定 (1% 锇酸 1 小时左右 )—— 漂洗( 0.1M 磷酸缓冲液, 3 次, 45 分钟) —— 块染( 1% 醋酸铀 2 小时) —— 梯度脱水( 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 100% 丙酮各 15 分钟, 100% 2 次,各 10 分钟) —— 浸透(丙酮:包埋液 =1 : 1 , 37 oC 烘箱 2 小时;丙酮:包埋液 =1 : 4 , 37oC 烘箱过夜;纯包埋液 45oC 烘箱 2 小时) —— 包埋聚合( 45oC 烘箱 3 小时, 65oC 烘箱 48 小时)。
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