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电镜标本取材方法及要求
[日期:2008-11-23]  来源:  作者: 
 

一、 组织和器官取材方法

事先准备好所需的器械和固定液,并把它放 4 ℃ 冰箱内预冷备用。如为穿刺物(肾组织、肝组织、脾组织等)、剪取物(胃镜剪取物、支气管镜剪取物、肠镜剪取物等)、手术切除物(肿瘤组织以及实验动物脏器等),均应在离体后迅速用生理盐水冲洗后或直接投入预冷的 2.5% 戊二醛固定液(保质期为 1 个月)内,并把它放 4 ℃ 冰箱内保存,一般要求在两分钟内完成。在处理手术切除物时,应事先准备好两把锋利的刀片(如剃须刀或手术刀)和蜡板,把固定液滴在蜡板上,再把切下来的脏器用手术刀切成小块,放在蜡板上的固定液中,接着用双刀片拉锯法(具体做法请向我室工作人员咨询)在固定液中将组织切成约 1 立方毫米大小或横切面约 1 平方毫米的长条形,然后用牙签或镊子(轻轻夹住,禁止挤压)把组织移入装有固定液的小瓶内,用医用胶布封好并做好标记。如为肺组织,应在固定液中充分震荡,使其完全沉到瓶底为止。

二、 游离细胞取材法

组织培养和游离细胞(如血细胞、脱落细胞以及细菌病毒等),常悬浮分散在介质中,首先必须将其凝集成团,然后进行固定,具体做法如下:

1 、血浆凝集法:将抗凝全血离心分层( 2000 转 / 每分钟, 10 ~ 20 分钟),用毛细吸管沿着管壁轻轻的将上清夜吸取(不要破坏白细胞层),接着用吸管吸取固定液,并沿着管壁将 2.5% 戊二醛固定液慢慢地加入进行固定,然后把它放在 4 ℃ 冰箱内保存。

2 、血浆(血清)混合法:如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成 悬液 放置于离心管内(最好是玻璃的),离心成团( 3000 转 / 分钟, 10 分钟),去上清液后加入 2.5% 戊二醛固定 10 分钟左右,再弃去多余的固定液,然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀,离心成团,去上清夜,用吸管吸取 2.5% 戊二醛固定液 沿着离心管壁缓慢滴入 ,尽量避免团块分散,静置于 4 ℃ 冰箱内固定备用。

3 、琼脂预包埋法:有些游离细胞离心后容易散开,可用此法处理。首先将细胞、细菌、病毒等用生理盐水制成悬液,然后离心成团( 2000 转 / 每分钟, 10—20 分钟),去上清夜,加 2.5% 戊二醛固定液预固定 1 小时以上,再离心,去上清夜,加磷酸缓冲液或生理盐水漂洗,再离心,如此循环操作 2 次备用。其次配制好 2% 琼脂水溶液,加热完全溶解后,保持在 50C ~ 55C 之间;再将上述离心物在水浴中加热至 50 ℃ 。第三,用热吸管吸取热琼脂加入到细胞团中,搅拌均匀,立即离心 5 分钟( 4000 转 / 每分钟,)。最后,待琼脂凝固后取出,修成约 1mm x 1mm x 1mm 大小放入 2.5% 戊二醛固定液中静置于 4 ℃ 冰箱备用。

三、 取材要求

电镜生物样品制备的关键在于制出的样品必须忠实地反映其生活时的状态,尽量避免“死后改变”和人为假象的发生,因此,取材这一步非常重要。取材要求如下:

1 、冷:取材的器械和固定液均应事先在 4 ℃ 冰箱内预冷。

2 、快:取材时动作要快,所用的刀片要锋利,一般要求在脏器离体后 1 ~ 2 分钟内取材完毕并放入 2.5% 戊二醛固定液内于 4 ℃ 冰箱内保存。另外,应避免对组织的挤压和人为损伤。

3 、小:为了能让组织充分固定,必须把组织切成尽可能小的块,一般要求组织块在 1 立方毫米左右或横切面为 1 平方毫米的长条形 , 而皮肤、肌腱等组织较致密,取材应在 1 立方毫米以内。

4 、准:由于电镜标本要求小块取材,为了电镜观察的准确性,取材部位必须要准确,而且,不同实验组的标本尽量取在相同部位(如心肌组织取左心室,则一律取左心室),否则,将无法比较,进而影响观察结果,最终导致电镜观察失败。

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