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细胞计数及活力测定
[日期:2008-11-23]  来源:  作者: 
 
 一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
1 、仪器与用品:普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)
2 、试剂: 0.4 %台盼兰, 0.5 %四甲基偶氮唑盐( MTT )、酸化异丙醇
3 、材料:细胞悬液
三、操作步骤
(一)细胞计数
1 、将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。
2 、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。
3 、静置 3 分钟。
4 、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:

细胞数 /ml = 4 大格细胞总数 / 4 × 10000

注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占 10% 以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

(二)细胞活力
1 、将细胞悬液以 0.5ml 加入试管中。
2 、加入 0.5ml 0.4% 台盼兰染液,染色 2 一 3 分钟。
3 、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。
4 、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
(三) MTT 法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT 分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。
l 、细胞悬液以 1000rpm 离心 10 分钟,弃上清液。
2 、沉淀加入 0.5 - 1ml MTT ,吹打成悬液。
3 、 37 ℃下保温 2 小时。
4 、加入 4 — 5 ml 酸化异丙醇(定容)。打匀。
5 、 1000 rpm 离心,取上清液酶标仪或分光光度计 570nm 比色,酸化异丙醇调零点。
注意: MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。
附: 1 、 0.4% 台盼兰染液配制:
台盼兰 0.4 克 加双蒸水至 100 ml 。
2 、 MTT 配制:
MTT 0.5 克 ,溶于 100 ml 的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。 4 ℃ 下保存。
3 、酸化异丙醇配制:
异丙醇中加入 HCl 使最终达 0.04mol/L 。

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