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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
[日期:2008-11-21]  来源:  作者: 
 
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷,消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R''< [m]>)的大小完全取决于分子量的高低,因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
一、试剂
30%丙烯酰胺液溶液: 丙烯酰胺30 g、双丙烯酰胺0.8g,溶于100ml水中,过滤后贮于褐色瓶中低温
保存,可用一个月。
分离胶缓冲液(pH 8.9):? 1 mol/l? HCl?? 48.0ml、 Tris? 36.3g? , 加蒸馏水到100ml
浓缩胶缓冲液(pH 6.7) :1 mol/l? HCl? 48.0ml?? 、 Tris?? 5.98g , 加蒸馏水到100ml
10%过硫酸铵:?? 100mg/ml
电极缓冲液(pH 8.3):甘氨酸?? 28.8 g、 Tris?? 6.0g 、SDS 1.0 g , 加蒸馏水到1000ml
染色液:250mg考马斯亮蓝R250溶于45.5ml 甲醇,加9.2ml冰醋酸,补水至100ml。? ?
脱色液:甲醇50ml,加冰醋酸75ml,用水稀释至1000ml。
样品处理液:1%SDS、1%巯基乙醇、溴酚蓝0.1%、60%蔗糖
标准蛋白溶液及供试品溶液的制备:取标准蛋白,加水制成每1ml中含2~5mg的溶液。

凝胶溶液的配制:

试?? 剂

浓缩胶

分离胶

分离胶缓冲液(pH 8.9)

2.5

2.5

2.5

30%丙烯酰胺液溶液

1.0

5.0

10.0

13.3

浓缩胶缓冲液(pH 6.7)

1.25

10%SDS

0.1

0.2

0.2

0.2

蒸馏水

7.54

12.34

7.34

4.04

10%过硫酸铵

0.1

0.05

0.05

0.05

TEMED

0.01

0.01

0.01

0.01

总体积(ml)

10

20.0

20.0

20.0

Acr浓度(g%)

3.0

7.5

15

20

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