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荧光原位杂交( FISH )和用引物介导的原位标记( PRINS )操作规程
[日期:2009-11-21]  来源:  作者: 
 

仪器设备

1 、 医用微波炉;

2 、 水浴锅;

3 、 OLYMPUS BX51 荧光显微镜;

4 、 OLYMPUS DP11 数字显微照相机。

FISH 试剂

( 1 ) 1 × PBS :由 10 × PBS 溶液稀释而成,储存于 4 ℃ ;

( 2 ) 20 × SSC ( pH7.0 );

( 3 ) 2 × SSC ,由 20 × SSC 溶液稀释而成;

( 4 ) 25mg/ml 蛋白酶 K 消化液。

( 5 )变性液 (70 %甲酰胺 +2 × SSC , pH7.0) : 4ml 20 × SSC ; 8ml 蒸馏水; 28ml 甲酰胺。每次新鲜配制。

( 6 )杂交后洗涤液: 20 × SSC 4ml ;蒸馏水 16ml ;甲酰胺 20ml 。每次新鲜配制。调节 pH 前升至室温。

实验步骤

1 、脱蜡:

1 )二甲苯脱蜡 3 次,每次 5min ;

2 ) 100 %酒精两次,每次 2min ;

3 )移出酒精,斜置切片,标记末段向下,空气干燥。

2 、蛋白酶处理 :

1 )每个染色缸 40ml 蛋白酶 K 消化溶液,配制方法如下: 2 × SSC 40ml 倒人 Facal 管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。

2 ) 37 ℃ 水浴槽中预热染色缸和蛋白酶 K 溶液。 37 ℃ 孵育 20min 。

3 ) × SSC 在室温下漂洗切片 3 次,每次 1min 。

4 )梯度酒精脱水( -20 ℃ 预冷)。

3 、变性:

1 )每一个立式染色缸配制 40ml 变性溶液;

2 ) 78 ℃ 水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

3 ) 78 ℃ 孵育 8min ;

4 ) 即移入 -20 ℃ 预冷 70% 酒精的染色缸内 2min ,再依次移入 80% 、 90% 和 100% 的 -20 ℃ 预冷酒精内,每缸 2min ;

5 )空气干燥。

4 、杂交:

1 )准备探针;

2 )取一个较大的湿盒,交叉放置切片;

3 )滴 10 μ l 探针在切片的组织上,加盖玻片;

4 )盖上湿盒盖, 37 ℃ 孵育 12h ~ 16h 。

杂交后的水洗:

5 )镊子小心去除盖玻片;

6 ) 43 ℃ 预热杂交后水洗溶液 40ml 水洗切片 15min ;

7 ) 2 × SSC( 37 ℃ ) 洗两次,每次 10min ;

8 )切片放人染色缸的 1 × PBS 内待检测,勿使切片干燥。

检测:

9 )从 1 × PBS 中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理 4 张切片。

10 )每张切片使用 30 μ l ~ 60 μ l 罗丹明抗 - 地高辛抗体或 FITC 卵白素,室温下孵育 20min ;

11 )去掉塑料盖膜,把切片放入含 1 × PBS 的染色缸。 1 × PBS 室温下洗 3 次,每次 2min 。

扩增:

12 )从 1 × PBS 中取出切片,斜置切片使液体排出;

13 )每张切片滴 30 μ l ~ 60 μ l 抗 - 卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育 20min ;

14 )去掉塑料盖膜,把切片放人含 1 × PBS 的染色缸。 1 × PBS 室温下洗 3 次,每次 2min ;

15 )从 1 × PBS 中取出切片,斜置切片使液体排出;

16 )每张切片滴 30 μ l ~ 60 μ l 抗 - 卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育 20min ;

17 ) 1 × PBS 室温下洗 3 次,每次 2min 。

5 、细胞核染色:

1 )张切片加 10 μ l ~ 20 μ l DAPI ,覆盖盖玻片并在室温下孵育 2 ~ 5ml ;

2 )尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在 -20 ℃ 冰箱。切片在染色之后 1h 内可以在显微镜下观察。 ?

PRINS 步骤

1 、常规脱蜡浸入 0.01mol/LPBS ;

2 、用 0.2mol/L 盐酸处理 5min ;

3 、蛋白酶 K(25 μ g/m1) 消化 37 ℃ 15min ;

4 、分别用 80 %, 95 %和 100 %酒精脱水,室温干片;

5 、加 PCR 混合液 25 μ L(10mmol/L Tris-HCl , 50mmol/L KCl , 1.5mmol/L MgCl2 ,各加 200 μ mol/L dATP , dCTP , dGTP , 1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5 μ l ,引物 250ng , Taq DNA 聚合酶 2U) ,加盖片;

6 、 94 ℃ 变性 5min 后置入 65 ℃ 湿盒中 5min ;

7 、用 0.1 × SSC 液, 65 ℃ 洗 5min ;

8 、片于 65 ℃ 10s ~ 20s ;用 4 × SSC-0.1 %吐温 20 液 42 ℃ 洗 5min , 2 次;

9 、经 Buffer I 液洗后滴加 20 %羊血清封闭 30min ;

10 、加地高辛抗体复合物 (1:500) 室温下 2h ;

11 、 Buffer Ⅲ液洗 5min ;

12 、用 BCIP-NBT 显色 1h ~ 2h ,在镜下控制,终止显色;

13 、用中性红或核固红衬染,酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片。

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