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原位杂交操作规程
[日期:2009-11-21]  来源:  作者: 
 
(一)、仪器设备

医用微波炉; 水浴锅。

(二)、试剂

0.2mol/L HCl : HCl 8.2ml , H20 定容 0.5L 。 0.1mol/L 三乙醇胺 (pH8.0): 三乙醇胺 5.33ml , H20 定容 0.4L 。 .5ml/L 醋酸 -2.5ml/L 醋酸酐 : 三乙醇胺 13.2ml , NaCl 5g ,浓 HCl 4ml , H20 定容 0.98L ,醋酸酐 (用前加) 2.5ml 。 20 × SSC(pH7.0) : NaCl 175.3g ,枸橼酸钠 88.2g , H20 定容 1L 。 100 × Denhardt's : Ficoll 1g , PVP 1g , BSA 1g , H20 定容 50ml 。杂交液: Formamide 5ml , 20 × SSC 2.5ml , Dextran sulfate 1g , 100 × Denhardt's 0.5ml , 10%SDS 0.5ml , 10g /L sperm DNA 0.1ml , H20 1.4L 。 Buffer Ⅰ( pH7.5 ): 0.1mol/L ris ? Cl , 0.15mol/L NaCl 。 Buffer Ⅲ( pH9.5 ): 0.1mol/L Tris ? Cl , 0.1mol/L NaCl , 0.05mol/L MgCl2 。 Buffer Ⅳ( pH8.0 ): 10mmol/L Tris ? Cl , 1mmol/L EDTA 。

(三)、操作流程

1 、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的 RNA 原位杂交第一天

1 ) 二甲苯于 37 ℃ 脱蜡 2 次,每次 15 分钟;

2 ) 无水乙醇浸泡 2 次,每次 3 分钟;

3 ) 95% 乙醇浸泡 2 次,每次 3 分钟;

4 ) PBS 清洗 3 分钟;

5 ) 2% 焦碳酸二乙酯室温下浸泡 10 分钟;

6 ) PBS 清洗 10 分钟;

7 ) 加入胃蛋白酶 25ul/ml , 37 ℃ 孵育 15 分钟;

8 ) PBS 清洗 2 次,每次 3 分钟;

9 ) 0.2N 的 HCl 孵育 30 分钟;

10 ) PBS 清洗 2 次,每次 3 分钟;

11 ) 0.25% 无水乙酸和 0.1M 三乙醇胺孵育 10 分钟;

12 ) PBS 清洗 2 次,每次 5 分钟;

13 )预杂交缓冲液孵育 30 分钟;

14 )准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针, 85 ℃ 加热 5 分钟,置于冰块中 10 分钟;

15 )杂交;第二天

16 )将玻片置于 SSC 中 2 次,每次 5 分钟以去除封片;

17 ) PBS 清洗 3 分钟;

18 ) RNA 酶 A 溶液中(或 0.1-1ng/mlPBS 中), 37 ℃ 孵育 30 分钟;

19 ) PBS 清洗 5 分钟;

20 )室温, 2 × SSC 清洗 10 分钟;

21 ) 37 ℃ , 1 × SSC 清洗 10 分钟;

22 ) 37 ℃ , 0.5 × SSC 清洗 10 分钟;

23 )缓冲液 A 孵育 10 分钟;

24 )缓冲液 A ( 1% 正常绵羊血清和 0.03% 三重氢核 X-100 )孵育 30 分钟;

25 )加入抗地高辛抗体( 1/200 的上述缓冲液,来自 Boehringer Mannheim ), 37 ℃ 孵育 3 小时;

26 )缓冲液 A 清洗 2 次,每次 10 分钟;

27 )缓冲液 B 清洗 2 次,每次 5 分钟;

28 )制成 NBT/BCIP 暗处保存 30-60 分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到 16 小时;

29 )停止缓冲液 B 的反应,用水进行简单的清洗;

30 )固红,脱水以及封片进行核的复染。

2 、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位 DNA 杂交第一天

1 ) 二甲苯于 37 ℃ 脱蜡 2 次,每次 15 分钟;

2 ) 无水乙醇浸泡 2 次,每次 5 分钟;

3 ) 95% 乙醇浸泡 2 次,每次 5 分钟;

4 ) PBS 清洗 5 分钟;

5 ) 2% 焦碳酸二乙酯室温下浸泡 10 分钟;

6 ) PBS 清洗 5 分钟;

7 ) 加入胃蛋白酶 25ul/ml , 37 ℃ 孵育 10 分钟;

8 ) PBS 清洗 2 次,每次 5 分钟;

9 ) 0.2N 的 HCl 孵育 30 分钟;

10 ) PBS 清洗 2 次,每次 5 分钟;

11 ) 0.25% 无水乙酸和 0.1M 三乙醇胺孵育 10 分钟;

12 ) PBS 清洗 5 分钟;

13 )预杂交缓冲液孵育 30 分钟;

14 )准备寡核苷酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针;

15 )杂交;第二天

16 )将玻片置于 SSC 中以去除封片;

17 )室温, 2 × SSC 清洗 10 分钟;

18 ) 37 ℃ , 1 × SSC 清洗 10 分钟;

19 ) 37 ℃ , 0.5 × SSC 清洗 10 分钟;

20 )缓冲液 A 孵育 10 分钟;

21 )缓冲液 A 孵育 30 分钟;

22 )加入抗地高辛抗体 37 ℃ 孵育 3 小时;

23 )缓冲液 A 清洗 2 次,每次 5 分钟;

24 )缓冲液 B 清洗 2 次,每次 5 分钟;

25 )制成 NBT/BCIP 暗处保存 30-60 分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可长到 16 小时;

26 )停止缓冲液 B 的反应,用水进行简单的清洗;

27 )固红,脱水以及封片进行核的复染。

阅读:
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