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免疫组化操作规程
[日期:2009-11-21]  来源:  作者: 
 

免疫组化操作规程

(一)、仪器设备

1 ) 18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;

2 )水浴锅

(二)、试剂

1 ) PBS 缓冲液( pH7.2 ~ 7.4 ): NaCl 137mmol/L , KCl 2.7mmol/L , Na2HPO4 4.3mmol/L , KH2PO4 1.4mmol/L 。

2 ) 0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液( CB , pH6.0 , 1000ml ):柠檬酸三钠 3g ,柠檬酸 0.4g 。

3 ) 0.5mol/L EDTA 缓冲液( pH8.0 ): 700ml 水中溶解 186.1gEDTA ? 2H2O ,用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。

4 ) 1mol/L 的 TBS 缓冲液( pH8.0 ):在 800ml 水中溶解 121gTris 碱,用 1N 的 HCl 调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。

5 )酶消化液: a 、 0.1% 胰蛋白酶液:用 0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b 、 0.4% 胃蛋白酶液:用 0.1N 的 HCl 配制。

6 ) 3% 甲醇 -H2O2 溶液:用 30%H2O2 和 80% 甲醇溶液配制。

7 )封裱剂:

a 、甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液( pH9.0 ~ 9.5 )等量混合;

b 、油和 TBS( 或 PBS) 配制。

8 ) TBS/PBS pH9.0 ~ 9.5 ,适用于荧光显微镜标本; pH7.0 ~ 7.4 适合于光学显微镜标本。

(三)、操作流程

1 、脱蜡和水化

脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60 ℃ 恒温箱中烘烤 20 分钟。

1 )组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟,更换二甲苯后再浸泡 10 分钟;

2 )无水乙醇中浸泡 5 分钟;

3 ) 95% 乙醇中浸泡 5 分钟;

4 ) 70% 乙醇中浸泡 5 分钟;

2 、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1 )抗原热修复

( 1 )高压热修复 在沸水中加入 EDTA ( pH8.0 )或 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液( pH6.0 )。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。 10 分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

( 2 )煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液( pH6.0 )至 95 ℃ 左右,放入组织芯片加热 10~15 分钟。

( 3 )微波热修复 在微波炉里加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液( pH6.0 )至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔 5~10 分钟,反复 1-2 次。适用的抗原有: AR , Bax , Bcl-2 , C-fos , X-jun , C-kit , C-myc , E-cadherin , Chromogranin A , Cyclin , ER , Heat shock protein , HPV , Ki-67 , MDMZ , p53 , p34 , p16 , p15 , P-glycoprotein , PKC , PR , PCNA , ras , Rb , Topoismerase Ⅱ等。

2 )酶消化方法 常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至 37 ℃ ,切片也预热至 37 ℃ ,消化时间约为 5~30 分钟;胃蛋白酶消化 37 ℃ 时间为 30 分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有: Collagen , Complement , Cytokeratin , C-erB-2 , GFAP , LCA , LN 等。

3 、免疫组织化学染色

SP 法

1 )脱蜡、水化;

2 ) PBS 洗 2 ~ 3 次各 5 分钟;

3 ) 3%H2O2 ( 80% 甲醇)滴加在 TMA 上,室温静置 10 分钟;

4 ) PBS 洗 2 ~ 3 次各 5 分钟;

5 )抗原修复;

6 ) PBS 洗 2 ~ 3 次各 5 分钟;

7 )滴加正常山羊血清封闭液 , 室温 20 分钟。甩去多余液体。

8 )滴加Ⅰ抗 50 μ l ,室温静置 1 小时或者 4 ℃ 过夜或者 37 ℃ 1 小时。

9 ) 4 ℃ 过夜后需在 37 ℃ 复温 45 分钟。

10 ) PBS 洗 3 次各 5 分钟;

11 )滴加Ⅱ抗 40 ~ 50 μ l ,室温静置,或 37 ℃ 1 小时;

12 ) II 抗中可加入 0.05% 的 tween-20 。

13 ) PBS 洗 3 次各 5 分钟;

14 ) DAB 显色 5 ~ 10 分钟,在显微镜下掌握染色程度;

15 ) PBS 或自来水冲洗 10 分钟;

16 )苏木精复染 2 分钟,盐酸酒精分化;

17 )自来水冲洗 10 ~ 15 分钟;

18 )脱水、透明、封片、镜检。

SABC 法

1) 脱蜡、水化。

2)PBS 洗两次各 5 分钟。

3) 用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2 ,室温封闭 5 ~ 10 分钟,蒸馏水洗 3 次。

4) 抗原修复。

5)PBS 洗 5 分钟。

6) 滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟。甩去多余液体。

7) 滴加Ⅰ抗 , 室温 1 小时或者 4 ℃ 过夜或者 37 ℃ 1 小时( 4 ℃ 过夜后在 37 ℃ 复温 45 分钟)。

8)PBS 洗三次每次 2 分钟。

9) 滴加生物素化二抗 , 20 ℃ ~ 37 ℃ 20 分钟。

10)PBC 洗 3 次每次 2 分钟。

11) 滴加试剂 SABC , 20 ℃ ~ 37 ℃ 20 分钟。

12)PBS 洗 4 次每次 5 分钟。

13)DAB 显色: DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。

14) 蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。

15) 脱水、透明、封片、镜检。

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