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原位 PCR ( in situ PCR )和原位 RT-PCR ( in situ RT-PCR )操作规程
[日期:2009-11-21]  来源:  作者: 
 

(一)、仪器设备
原位 PCR 仪。
(二)、操作流程
1 、原位 PCR 步骤
1 )预处理:
( 1 )切片常规脱蜡;
( 2 ) 0.2mol/L HCl 处理 10min ;
( 3 ) 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化组织 37 ℃ 10min ;
( 4 ) Nase 消化组织 37 ℃ 30min ;
( 5 )梯度酒精脱水,室温干燥。
2 )原位扩增:
( 1 )切片滴加特异性序列引物 30 μ LPCR 扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
( 2 ) PCR 热循环: 94 ℃ , 1min ; 55 ℃ , 1min ; 72 ℃ , 1.5min ,共 25 ~ 30 个循环, 72 ℃ 延伸 10min ;
( 3 )氯仿洗去盖玻片, 4 %多聚甲醛后固定 10min ,梯度酒精脱水,干燥。
3) 原位杂交:
( 1 )加地高辛标记探针的杂交液, 98 ℃ 变性 10min , -20 ℃ 退火 5min , 42 ℃ 杂交过夜。
( 2 )杂交后用 2 × SSC 洗涤 10min , 3 次, 1 × SSC 洗涤 10min , 3 次;
( 3 )缓冲液洗涤 10min , 3 次;
( 4 )加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物, 37 ℃ , 2h ;
( 5 )缓冲液洗涤 5min , 3 次;
( 6 ) NBT 、 BCIP 暗处显色,镜下控制,终止显色。
( 7 )常规脱水:透明、封固。
2 、原位 RT-PCR 步骤
1 )预处理:
( 1 )蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃ 消化 20min ,蒸馏水洗;
( 2 ) 95 ℃ 加热 3min ,灭活残存的蛋白酶。
2 )原位扩增:
( 1 )在有 RNA 酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
( 2 )用热启动法进行 PCR 扩增。标本加热至 75 ℃ 时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封。然后将温度升至 95 ℃ , 2min 。再将热循环仪设定为 95 ℃ , 45s , 55 ℃ , 1min 和 75 ℃ , 45s ,共 26 次循环;
( 3 )扩增结束后,在 80 ℃ 烤 15min ~ 30min 。
3 )原位杂交:
( 1 )杂交前标本 95 ℃ 加热 3min ;
( 2 )加上杂交液,湿盒内 50 ℃ 过夜;杂交液组成: 25 %硫酸葡聚糖, 2 × SSC , 50 %甲酰胺, 0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子 DNA , 每 0 . 5mL 杂交液内含生物素标记探针 1ng 。
( 3 )扩增的β - 肌动蛋白和 IL-6 用 DAKO 检测试剂盒 K600( 链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝 ) 检测。阳性反应呈紫色。

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