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骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
[日期:2009-11-21]  来源:  作者: 
 
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,应用最多的是 Sp2/0 细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长密度为 9×105 /ml ,倍增时间通常为 10 ~ 15 小时。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性俱佳的细胞(活性应大于 95% )。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含 8- 氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为 2×105 /ml ,次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞( feedercells )。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中有巨噬细胞和其他细胞。 亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至 1×105 /ml ,提前一天或当天置板孔中培养。
(一)细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入 PEG 使细胞彼此融合。其后以培养液稀释 PEG ,消除 PEG 的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。 ① 细胞比例 骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从 1:2 到 1:10 不等,常用 1:4 的比例,应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。 ② 反应时间 在两种细胞的混合细胞悬液中,第 1 分钟滴加 4.5ml 培养液;间隔 2 分钟滴加 5ml 培养液,尔后加培养液 50ml 。 ③ 培养液的成份 对融合细胞而言,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。
(二)有限稀释法
筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为 HAT 敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能持续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至 0.8 个细胞 / 孔),按 Poisson 法计算,应有 36% 的孔为 1 个细胞 / 孔。细胞培养至覆盖 10% ~ 20% 孔底时,吸取培养上清用 ELISA 检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的 ELISA 测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
(三)单克隆抗体的制备和冻存
筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染色体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法, 即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小 鼠腹腔接种法。选用 BALB/C 小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集 5 ~ 10ml 的腹水 , 有时甚至超过 40ml 。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为 5×105 /鼠,可根据腹水生长情况适当增减。
选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好,冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低,而冻存在 -70 ℃ 冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。二甲亚砜( DMSO )是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在 50% ~ 95% 之间。如果低于 50% ,则说明冻存复苏过程有问题。
(四)单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水中特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果较好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般 采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简便的酸沉淀方法。目前最有效的单抗纯化法为亲和纯化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免 疫球蛋白抗体与载体(最常用 Sepharose )交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达 90% 以上。A蛋白可与 IgG1 、 IgG 2a 、 IgG2b 和 IgG3 结合,同时还结合少量的 IgM 。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠抗 IgG 单抗溶液在 A280nm 时, 1.44 (吸光单位)相当于 1mg/ml 。经低 pH 洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
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