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FCM 在生物医学工程学方面的应用4
[日期:2008-11-21]  来源:  作者: 
 

( 1 )全血染色后溶解红细胞:由于不少血液标本具有生物危害性,用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行,这样减少转换过程中的污 染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节 省时间。由于此法未将粒细胞去除,故在用 FCM 分析时,要注意排除粒细胞的干扰。
具体操作步骤如下:
① 全血 100 ~ 150μl ,放入 5ml 试管,并用 50 ~ 100μl PBS 稀释,总体积为 200μl 。 ]
② 荧光标记的单克隆抗体染色 30min , 4 ℃ (或放于冰上)。单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大,但为了使用方便,可按其说明书配成每次实验使用 10μl 。注意蔽光。
③ 用 3 ~ 4μl 冷 BPS 清洗。离心 250×g (约每分钟 1500 转), 5min ,洗 3 次。注意每次用吸管将上清吸出,决不能倾倒去液!
④ 用 2ml 氯化铵液(配法见下)在室温下溶解红血球,约 10min 。若红细胞完全被溶解,溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要:若溶解过分,则导致白细胞上抗原被破坏,或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改 变。若溶解不彻底,大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近,在框出淋巴细胞群时,会把部分红细胞框定于淋巴细胞 内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。
【氯化铵液的配制】
Tris— 氯化铵 1× 氯化铵
0.16mol/L NH 4 Cl 0.38g/100ml 90ml 0.16mol/L NH 4 Cl
0.17mol/L Tris 2.06g/100ml 10ml 0.17mol/l Tris
pH 值 7.56 pH 值 7.2
⑤ 红细胞被彻底溶解,加入 1ml PBS 稀释的 0.5% 甲醛,立即离心,洗 3 次,条件同步骤 ③ 。加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原,避免有生物危害的标本到处污染。
⑥ 将染色完成的细胞悬浮于 0.5 ~ 1ml 的 0.1% 甲醛溶液内。置 4 ℃ ,蔽光,等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周,这样对工作的安排会带来方便。
( 2 )红细胞被溶解后再对白细胞染色:此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感,溶解红细胞后,还要经过多个染色步骤,这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下:
① 室温下放入 14ml 氯化铵在 15ml 的试管里。
② 加入 0.5 ~ 1ml 全血,混合 3 ~ 5min 。
③ 立即离心 100 ~ 150×g ,并用 PBS 洗 2 次。
④ 白细胞计数,注意存活率应在 90% 以上。做成每毫升含 5×10 6 白细胞悬浮液。将细胞分配到 5ml 的试管,每试管 0.2ml ,即 1×10 6 个细胞。
⑤ 荧光标记的单克隆抗体染色 30min , 4 ℃ ,避光。抗体浓度配制如前所述。
⑥PBS 洗 3 次后,用 0.5% 甲醛固定。方法如前。
( 3 )用 Ficoll—Hypaque 梯度离心法分离出单个核细胞:用此法可以分离骨髓细胞、淋巴结、扁桃体捣碎后的单细胞悬液等。血液标本应有抗凝剂。取血到分离不能超过 6h 。
① 抗凝全血 4 ~ 20ml ,用等量 PBS 或 Hanks 液稀释。
② 稀释血 8 或 40ml 置于 15 或 50ml 离心管内, 4 或 10ml Ficoll—Hypaque (或者等量的其它分离液,比重为 1.007 )从离心管底部轻轻加入到血的下面。这种方法对血的扰动较小,比将全血加到 Ficoll 上面为好。加完后,可以清楚看到 Ficoll 与全血之间有一明显的分界线。注意在 Ficoll 快加完时应特别小心,否则有可能加入气泡搅混血样,使血与分离液混合,达不到分离的目的。
③ 离心 350 ~ 400g,30min 。红细胞、粒细胞以及死细胞将位于离心管底部,中间层的单个核细胞为淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。
④ 取出中间层中所有细胞,若在 Ficoll 中还有细胞也要取出,这也是单个核细胞( PBMC )。
⑤ 用 PBS 洗 3 次,第 1 次清洗时,可用较快速 400×g 离心 10min 。因为有可能中间层中混有一些 ficoll ,比重增加而细胞不易沉降。
⑥PBMC 计数,注意存活率应高于 90% 。配成 5×10 6 个 /ml 的细胞悬浮液。
⑦ 取出 0.2ml 的悬浮液加入到 5ml 试管(内含 1×10 6 细胞),用荧光标记的单克隆抗体染色,方法如前。洗 3 次后固定。注意必须先染色后固定,固定后的细胞膜通透性改变,会导致荧光标记的抗体进入细胞中去,而在显微镜下观察的染色效果则和死细胞一样。当用 FCM 分析时,则均为阳性而达不到检验目的。这也是用 FCM 分析的细胞存活率应高于 90% 的原因。
( 4 )荧光标记抗体的细胞染色:如前所述, FCM 分析被荧光标记的抗体染色的细胞,在选择荧光染料时必须注意这些荧光染料所需要的激发光波长是否与所使用的 FCM 的激发光谱相匹配。一般各个公司所采用的绿色荧光染料为 FITC ,而选用的红色荧光染料却不尽相同,有的用 TRITC ,有的用藻红蛋白( PE ),所需要的激发光谱就不一样,因而若因匹配不当则会招致荧光抗体所染的细胞分析不出来,这是应该注意的。
这里的标本染色方法和免疫荧光法相同。下面仅说明一些具体的注意事项:
① 在用间接法染色时,染色步骤依次为第一抗体 → 清洗 → 第二抗体 → 清洗 → 红细胞溶解。为了实验的方便,将第二抗体也配成每次实验用 10μl 。
② 双色法:双色法多用于直接染色法。将分别用 FITC 和 PE 标记的抗体各 10μl 置入同一个含有约 1×10 6 /0.2ml 的试管内, 30min , 4℃ 避光。然后清洗、固定。

  
目前不少制备单克隆抗体的公司已将比值有意义的两种抗体,分别用红、绿荧光染料标记后,制成一种试剂。如 CD 2 —FITC/CD 20 —PE ; CD 4 -FITC/CD 8 -PE 等。可按说明使用,具体用量为每次实验 10μl 。
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