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FCM 在生物医学工程学方面的应用2
[日期:2008-11-21]  来源:  作者: 
 

临床肿瘤病学已经注意到细胞动力学的重要性。研究工作表明:肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感程度与细胞的增生率高低密切相关;采取细胞同步化( Cell Synchronization )措施可以提高疗效。例如可以使用雌激素这种外源性药物让雌激素受体阳性的乳腺癌细胞同步化。
临床微生物学可以用 FCM 对大量细菌的 DNA 和 RNA 含量进行测量,进行微生物鉴定、医学常规中的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。
FCM 优良的分析和分选功能在分子遗传学领域也能充分发挥。例如流式细胞核型分析技术就是用 FCM 对染色体进行分类、纯化,检测或定量测量细胞表面或内部由特异基本所编码的成份。这方面的成果已用在畜类性别的预选择,以及对人类计划生育等方面的工作。
2 .在免疫学方面的应用  FCM 以它的快速、灵活及定量的特点被广泛地应用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面,尤其是结合单克隆抗体技术,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测、 机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重要作用,成为现代免疫技术的重要组成部分。基于免疫技术是免疫细胞化学分析技术的基 础,我们着重介绍 FCM 在免疫应用中的技术问题。
( 1 )免疫应用的激发光源和滤片系统:适用于免疫技术的 FCM 的激发光是氪离子气体激光器,光谱中波长为 531nm 和 856nm 的谱线最强。为了扩大仪器对双标记或三标记染色的荧光信号的分辨范围可使用双激光光源。
为了减少细胞由于激光束造成的散射光对光电倍增管的影响,要使用贴有干涉膜的滤片系统。为了同时测定两种波长以上的荧光信号,光路中还要使用二向性分光元件。
为了测定伴随细胞转化过程所产生的早期免疫及生化性质的改变,例如膜的流行性, DNA 构象变化等,可以使用偏振片。
总之,应用于免疫学时要充分考虑有关光源及光学滤片系统的正确使用。
( 2 )免疫应用的荧光 染料 及染色:免疫应用中的荧光 染料 主要有 FITC ( 488nm )、 TRITC ( 515nm )、 PE (藻红蛋白, 575nm )及其组合。在进行多种标记时特别要注意结合抗体的每种色素都不干扰抗体反应的特异性,也不相互干扰。
免疫荧光染色有直接法和间接法二类:
① 直接染色法
1 )取约 10 6 的细胞置于尖底离心管内,管内液体要少些。加荧光标记抗体,在 4℃ 温度下静置 15 ~ 30min 。若作双标记染色也可直接加入。
2 )用冷的 10% 的小牛血清、 0.1% 的叠氮钠溶液, 1/15mol/L 的 PBS ( pH4.4 )离心清洗细胞 2 次。 1000rpm 离心 5min 或 4000rpm 离心 1min 。
3 )加入适量缓冲液待测。
② 间接染色法:
1 )取 10 6 细胞加特异的第一抗体, 4 ℃ 温度下静置 15 ~ 30min 。
2 )加缓冲液离心清洗 2 次后,吸尽残留液体,弹散沉淀,加入荧光标记的第二抗体, 4 ℃ 静置 30 min 。
3 )缓冲液离心清洗 2 次后加入适量缓冲液待测。为减少无关因素干扰,操作尽量在水浴中进行。
染色中应注意的事项: ① 细胞标本在整个过程中要尽量保持新鲜,采用有效措施防止表面抗原消失和细胞死亡; ② 荧光标记物用前应用滤膜或高速离心去除颗粒或沉渣以减少非特异性干扰; ③ 细胞标本染色前应除死细胞; ④ 为提高灵敏度可用三步间接染色法。
( 3 )免疫荧光标本的特殊处理:
① 死细胞及碎片去除:样品中不可避免地存在着死细胞及碎片,影响分析结果。对于血细胞可用 FCM 通过 0 。 散射的差异不经染色而将死细胞分出弃除;对于培养细胞,由于其大小分布不均,可在样品内加少量 PI 染色后将死细胞去掉。一般情况下即可用仪器直接去除碎片,也可用血清沉降法去除大碎片,用离法去除小碎片。
② 标本的保存和固定:实验中大多数样品在染色或分析前需要保存一定的时间,有时甚至需要进行固定。
未染色的新鲜标本贮存方法如下: 10% 二甲基亚砜, 90% 小牛血清, 5×10 6 ~ 1×10 7 细胞在 -70 ℃ 过夜,然后置液氮中可长期保存。
免疫染色未经固定的标本在 4 ℃ 可保存 48h 。若需存放时间较长、或标本具有传染性,应该用固定剂固定。常用的固定剂配方是: 1% ~ 4% 的多聚甲醛和 PBS 或 0.8% 的生理盐水配成 p H7.2 的固定液;或用 0.37% ~ 1.5% 甲醛和 PBS 配成 p H7.4 的固定液。固定方法是:将经免疫荧光染色的细胞离心沉淀,再加入固定液混匀,放在 4 ℃ 温度保存。一般来说,经固定处理的标本保存 1 周至 2 个月,多数样品的阳性细胞群体比例及荧光强度增色能保持在正常范围之内。
( 4 )主要检测的免疫指标:
① 细胞毒试验:细胞毒是机体的一种免疫监督机制,细胞毒实验是一项重要的免疫指标。例如天然杀伤细胞 NK ( Natural killer )是一种引起免疫媒介的效应物,在抗肿瘤及感染因子的免疫监督系统中起着重要作用。研究表明,对 NK 细胞的测量可以做为免疫治疗监测的重要参数和有效的预后征状的指标。所使用的荧光探针为 CFDA ( Caboxy-fluorescein diacetate )。
② 吞噬功能实验:单核吞噬细胞系统是机体的主要防御系统之一。 FCM 可以快速、定量地检查吞噬细胞的吞噬能力和速度。
③I 型变变态反应的 IgE 受体细胞、 IgE 结合因子的检查。
④ 胞浆 Ig 及血清 Ig 分析,血小板表面的 IgG 测定,等等。
3 .在临床方面的应用 FCM 在临床诊断、疗效评价和预后预测等方面都发挥了一定的作用。工作做得较多的主要在肿瘤学、血液病学等。这些都和 FCM 在荧光细胞化学中的直接应用有关。

   
( 1 )癌前病变的检测和预后评价:有效地发现癌前病变而给予阻断治疗,无疑是肿瘤防治的重要环节 。 FCM 的探测对象主要是癌前细胞,即那些处于正常细胞向癌细胞转化的量变阶段、尚未达到质变的细胞。研究表明,除心肌、肝组织及精子细胞外,人类正常的体细胞都 具有恒定的 DNA 二倍体含量,而那些癌前细胞和癌细胞则在其发生发展过程中伴有 DNA 含量变化异常。另在资料表明:癌前病变向癌变的转化发生率与细胞的不典型增生程度有关,而细胞的不典型增生程度又与 DNA 含量的异常改变呈平行关系。利用 FCM 可以定量地测出癌前细胞的 DNA 含量并根据 DNA 分布直方图直观地反映出细胞的周期分布状态,从而了解到癌前细胞增殖能力变化的动态过程,这样便可以获得一些从组织形态学中难以得到的信息。
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