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FCM 在生物医学工程学方面的应用1
[日期:2008-11-21]  来源:  作者: 
 

流式细胞术在细胞生物学、分子遗传学、微生物学、免疫学、分子生物学以及临床肿瘤学、临床血液学等诸多领域都有广泛应用。本节 概要介绍它们的技术途径及主要原理,大家可以从中看出它们是和细胞化学密切相关的。
一、 FCM 应用的技术途径
FCM 是通过测量细胞的多种参量来获取信息的。细胞参数分为结构参量和功能参量两大类。结构参量主要用于描述细胞的化学组分和形态特征;功能参量主要是描述细胞整体的理化和生物特性。这些参量有的需要经荧光标记方可测定,有的并不需要荧光标记。 DNA 以及 RNA 的含量,蛋白总含量、胞内 pH 值和细胞大小等为结构参数;细胞周期动力学、特殊配体的鉴定、特殊细胞的生物活性等则为功能参数。
1 . DNA 和 RNA 的测量和分析 DNA 和 RNA 的含量可以用多种荧光探针标记后测出。对细胞内 DNA 含量的测定可用于细胞生物学方面的研究和临床肿瘤学的诊断;测量 RNA 的含量可用于血液中的网织红细胞的检测和计数; DNA 和 RNA 含量的测定可以用于区别细胞周期中的 G 0 和 G 1 期。常用的荧光探针有吖啶橙( AO , Acridine·orange )、派洛宁 Y ( PY , Pyronine Y )、 HO ( Hoechst )系列和色霉素 A 3 ( CA 3 )等。利用 HO/CA 3 双染色还可分析 DNA 的碱基组成。还可以结合 Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脱氧尿嘧啶核苷 ) 单克隆抗体免疫荧光来测定细胞内 DNA 合成。
2 .蛋白质总量测定用 FCM 可以测定细胞中蛋白的总含量,以检测一个细胞群体生长和代谢的状态,或区别具有不同蛋白含量的细胞亚群,如血液中的白细胞的分类。检测总蛋白的常用荧光探 针为异硫氰基荧光素( FITC , Fluorescein isothiocyanate ), FITC 以共价键方式与蛋白上带正电的残基结合。
3 .特殊配体的测定配体是与不同的细胞结构特异结合很强的各种大分子和小分子,通过对特异性的荧光标记的配体的测定可以获得不少有关结构参量和功能参量的信 息。例如用标记的外源凝集素可检测细胞表面糖;用标记抗体可测表面抗原;用标记多聚阳离子可检测细胞表面电荷;用标记的激素、生长因子、神经递质和病毒等 可检测细胞受体;用标记的大分子、微生物等可检测细胞的内吞性;用荧光素标记的亲和素以及带有 DUTP 的生物素衍生物的 DNA 探针跟靶细胞的 DNA 杂 交能够检测原位的特殊基因等。这方面的应用范围广、有前途,已经成为研究细胞和组织中的抗原、基因和各种生化过程的强有力的新技术。用于这方面工作的荧光 探针主要有 FITC 、若丹明系列(如四甲基异硫氰基若丹明 TRITC 、异硫氰基若丹明 X-RITc 和美国德州红等)、藻胆蛋白系列等。由于各种荧光探针具有不同的光谱特性,在使用中要注意正确地使用激光光源和滤片。
4 .生物活性的测定就生物流行性来说,主要包括两方面工作: ① 细胞本身的死活; ② 活细胞生物功能发挥的强弱。前项工作单一,后项工作要复杂得多。 FCM 用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类:一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质;例如下醋酸酯荧光素( FDA , flourescein Diacetate )它可被活细胞持留而发出黄绿色荧光;若细胞有损伤则会从细胞中流失,观察不到荧光。另一类是不能透过活细胞膜,但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进 行染色,例如碘化丙啶( PI,Propidium iodide )和溴化乙锭( EB,Ethidium bromide )就是常用的第二类荧光探针。
用 FCM 来测定活细胞生物功能发挥方面和性能的指标很多。例如可用来测细胞膜电位、细胞内 pH 值和细胞内钙等,这些都和细胞的激活密切相关。 FCM 也可用来测膜结构的流动性或微粘度等。有报告可以用 FCM 代替 51 Cr 的放射免疫分析来测定天然杀伤细胞( NK, Natu-ral killer cells )对靶细胞毒理学活性的大小。
二、 FCM 的典型应用简介
下面简单介绍 FCM 在各个领域中应用的典型实例,以求对 FCM 应用的全面了解,并能深入了解 FCM 在免疫细胞化学中应用的背景。
1 .在细胞生物学方面的应用细胞生物学是 FCM 应用最广泛也是最基本的领域,细胞周期分析是其基本分析内容之一,而实施的技术途径是通过测定细胞周期各时相的 DNA 含量来达到的。
众所周知,细胞周期由 G 1 期、 S 期、 G 2 期和 M 期所构成的。各期细胞的 DNA 含量如下: G 1 期为 2C , G 2 期和 M 期为 4C , S 期则在 2C 到 4C 之间。所以在 FCM 的 DNA 直方图上形成的谱线则为峰分布,而且 G 1 峰的道数恰好是 G 2 和 M 峰道数的一半(图 10-7 )。研究表明:对于正常细胞群,各周期时相的细胞数的比例是同一的;对于恶性病变的细胞群则是非均一的(图 10-8 )。

图 10-7  细胞周期的 DNA 直方图

图 10-8  细胞周期中的细胞数目与肿瘤的关系

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